Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida (A. salmonicida) es un patógeno que provoca pérdidas económicas importantes en la acuicultura. A. salmonicida es el agente etiológico de la forunculosis, una enfermedad sistémica que se caracteriza por producir una elevada mortalidad y morbilidad. Esta bacteria es conocida principalmente como patógeno de salmónidos, sin embargo en la actualidad el número de hospedadores a los que puede infectar se ha visto ampliado, incluyendo otras especies de peces no salmónidos de importante valor económico, como el rodaballo (Scophthalmus maximus), el bacalao (Gadus morhua) o el lenguado (Solea senegalensis).
Todos los estudios coinciden al afirmar que las causas de patogenicidad en esta especie dependen de factores de virulencia diversos, y a pesar de ser una especie patógena reconocida desde hace muchos años, aún no se ha logrado entender exactamente la interacción de la bacteria con el hospedador. Algunos de los factores de virulencia más importantes en esta bacteria son: la capa-A (proporciona protección a la bacteria), los productos extracelulares (ECPs: contribuyen al desarrollo de la enfermedad) y el sistema de secreción de tipo III (T3SS: translocación de toxinas al hospedador).
El equipo de Microbiología Marina del grupo BYCIAMA de la Universidad de Vigo, se ha centrado durante los últimos años en el estudio de cepas de A. salmonicida aisladas de rodaballo, y ha demostrado que presentan y expresan genes de virulencia (asociados a diferentes estados de la infección) que al igual que para las cepas de salmónidos, no parecen ser determinantes únicos de su virulencia. Además, también han demostrado que cepas de A. salmonicida que presentaban un grado de virulencia diferente, compartían el mismo perfil genético de los factores de virulencia más populares de esta especie. También se ha clarificado cuál es la ruta de infección de esta especie y su persistencia hasta causar la muerte en rodaballo. Los resultados evidenciaron que A. salmonicida entra a través del mucus, branquias y/o intestino del pez, y rápidamente coloniza sus órganos internos, persistiendo al menos durante siete días, al cabo de los cuales produce la muerte al pez. Por el contrario las cepas avirulentas raramente colonizan los órganos internos y son eliminadas de los tejidos del pez al cuarto día tras la infección.
El quorum sensing (QS) es un mecanismo de comunicación bacteriana, basado en la expresión y reconocimiento de pequeñas moléculas señal, que permiten a las bacterias sincronizar la expresión de genes con la densidad poblacional (Figura 1). Las moléculas señal son excretadas extracelularmente y cuando se alcanza una cierta concentración umbral en el exterior difunden al interior de la célula y se unen a una proteína receptora; este tándem, actúa activando o reprimiendo la expresión de genes, entre ellos varios de los implicados en la virulencia de las bacterias.
Figura 1. Esquema del funcionamiento del quorum sensing. Fuente: http://www.advancedhealing.com/quorum-sensing-and-biofilm/
Los estudios de los mecanismos de QS en otros patógenos hicieron plantearse al grupo de investigación que éstos en A. salmonicida podrían regular la dinámica de expresión de genes de virulencia y otros, marcando la diferencia entre un comportamiento virulento y avirulento de las cepas. Por ello se desarrolló la tesis doctoral de Leticia Rivera Fernández.
En dicho trabajo se investigó si el sistema de QS que presenta esta bacteria, denominado AsaI/R, y que apenas ha sido explorado en dicha especie, podría estar implicado en la regulación de la expresión de factores de virulencia y la virulencia de dicha bacteria.
Para ello se emplearon dos cepas de A. salmonicida que se caracterizaron por presentar: un comportamiento distinto en la virulencia, el mecanismo de QS AsaI/R y los únicos genes que han sido confirmados previamente como esenciales para la virulencia de esta especie, y que son los genes ascC y ascV del T3SS. Se emplearon además cepas mutantes para los genes de QS asaI o asaR, y cepas en las que dichas mutaciones fueron complementadas.
En todas ellas, se estudió la expresión de los genes de virulencia (cuantificación de la expresión de los genes ascC y ascV, incluidos en el T3SS). También se analizó si existían diferencias en el grado de virulencia (determinación de la dosis letal 50 (DL50) tanto por inoculación intraperitoneal como por baño de rodaballo) y la capacidad de producir infección en rodaballo (determinación de la distribución de la bacteria en el pez mediante ensayos de inoculación por baño), para lo cual se realizaron los experimentos en las instalaciones de la ECIMAT (Figura 2). Se estudió, también, cómo interaccionaban entre sí los genes del propio sistema QS, asaI y asaR (mediante la cuantificación de la expresión génica de los mismos).
Figura 2. Instalaciones en la ECIMAT. © Leticia Rivera Fernández
En el estudio se aplicaron tanto técnicas microbiológicas, como diversas técnicas de biología molecular, siendo fundamentales la mutación y la cuantificación de la expresión génica mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), que requirió de una puesta a punto previa. Dicha puesta a punto incluyó la selección de genes de referencia adecuados y la evaluación de su estabilidad empleando diversos algoritmos, además se evaluaron también distintos modelos de cuantificación relativa. Todos estos métodos supusieron una mejora para la selección de genes de referencia y de modelos de cuantificación para la obtención de datos precisos de expresión génica en bacterias mediante qPCR, con respecto a los métodos ya existentes. Por lo tanto, en estudios futuros, ésta sería la herramienta recomendada para cuantificar la expresión de los genes, en esta especie y en otras bacterias.
Los resultados obtenidos han aportado información relevante sobre el funcionamiento y el papel regulador del sistema de QS AsaI/R de A. salmonicida. Así mientras el patrón de regulación del gen asaR, fue similar en ambas cepas hay indicios de que, el gen asaI juega un papel diferente, pudiendo ser estas discrepancias la clave para explicar las diferencias en el comportamiento virulento y en la capacidad infectiva de ambas cepas.
El estudio, en último término, ha permitido mejorar el conocimiento sobre los factores de virulencia que regulan la capacidad de A. salmonicida de producir enfermedad en el hospedador, lo que será de gran utilidad para el desarrollo de estrategias de prevención y control de la enfermedad más eficaces.